Содержание

Химическая работа за счет ΔμH      Н+-АТФ-Синтаза      Н+-Пирофосфат-синтаза      Н+-Трансгидрогеназа Осмотическая работа за счет ΔμH      Определение и классификация      Δψ как движущая сила      ΔpH как движущая сила      Общая ΔμH как движущая сила      ΔμH - Зависимые транспортные каскады      Карнитин как пример трансмембранного переносчика химической группировки      Некоторые примеры ΔμH - зависимых белков-переносчиков      Роль ΔμH в транспорте макромолекул Механическая работа за счет ΔμH: движение бактерий      Структура флагеллярного мотора бактерий      ΔμH вращает ротор флагеллярного мотора      Возможный механизм Н+-мотора      ΔμH - Зависимая подвижность прокариот, не содержащих флагелл, и        внутриклеточных органелл      Подвижные симбионты эукариот и прокариот ΔμH как источник энергии для образования теплоты      Три способа превращения метаболической энергии в теплоту      Терморегуляторная активация свободного дыхания у животных      Терморегуляторная активация свободного окисления у растений

Скелетные мышцы. Работы по изучению действия кратковременного охлаждения животного на митохондрии были начаты в 1960 г. автором совместно с С. П. Масловым в лаборатории С. Е. Северина. Опыты проводили на голубях, которых предварительно остригали, чтобы исключить физическую терморегуляцию. Клетку с животным помещали в холодильник на -20°С и включали вентилятор. Голубь, впервые помещенный в эти жесткие условия, выдерживал 15-20 мин, после чего наступало резкое снижение температуры тела. Однако при повторном охлаждении, которому подвергали голубя на следующий день, животное лишь несколько снижало температуру своего тела, после чего она стабилизировалась, и голубь мог выдерживать охлаждение часами.

Изучение митохондрий, выделенных из грудной мышцы голубя, охлаждавшегося, впервые, показало снижение коэффициента Р/О в 1,6 раза по сравнению с неохлаждавшимися животными. Второе охлаждение вызывало снижение Р/О в шесть раз, т. е. наступало почти полное разобщение дыхания и фосфорилирования.

Дальнейшее исследование этого эффекта показало, что степень разобщения достигает максимума уже через 15 мин после помещения животного на холод. Разобщение в мышечных митохондриях могло быть продемонстрировано не только у птиц, но и у млекопитающих.

Было показано также, что концентрация высокоэнергетических соединений возрастает при первом охлаждении и падает при втором. Этот факт свидетельствовал по меньшей мере о том, что мышцы некоторым образом вовлечены в исследуемый терморегуляторный ответ. Измерение дыхания in vivo выявило его стимуляцию как при первом, так и при повторном охлаждении животного. В первом случае стимуляция сменялась прогрессирующим торможением дыхания, в то время как во втором случае торможения не наступало. Именно таких соотношений можно было ожидать, если животное, охлаждаясь впервые, не успевало в должной степени разобщить дыхание и фосфорилирование, и избыточное потребление кислорода приводило к избыточному синтезу АТФ и торможению дыхательной цепи по механизму протонного контроля. При втором действии холода происходило сильное разобщение, предотвращавшее накопление АТФ и исчерпание АДФ, так что состояние дыхательного контроля не наступало. Но если эта логика верна, то введение животному искусственного разобщителя-протонофора при первом охлаждении могло бы спасти организм от скоропостижной холодовой смерти. Опыты, поставленные С. П. Масловым, подтвердили это предсказание. Инъекция 2,4-динитрофенола, являющегося токсичным для животных, тем не менее значительно увеличивала продолжительность жизни на холоде мышей, впервые подвергнутых охлаждению.

В других опытах было показано, что дыхание интактной мышцы диафрагмы крысы активируется при повторном охлаждении животных. Одновременно снижается степень стимуляции дыхания ткани динитрофенолом. Эффект, подобный охлаждению, мог быть вызван инъекцией животному норадреналина.

Дальнейшее исследование показало, что концентрация жирных кислот значительно возрастает в мышцах животных, подвергнутых повторному воздействию холода. Было получено несколько независимых свидетельств роли свободных жирных кислот в качестве медиаторов терморегуляторного разобщения в мышцах.

1. Связывание жирных кислот при промывании митохондрий раствором предварительно обезжиренного сывороточного альбумина повышало Р/О в митохондриях из мышц охлажденных животных.

2. Фракция жирных кислот, выделенная из мышц охлажденных животных и добавленная к митохондриям контрольных животных, вызывала разобщение.

3. Пальмитиновая кислота в концентрации всего 1·10-5 моль/л заметно стимулирует дыхание мышечных митохондрий в состоянии дыхательного контроля, причем этот эффект подавляется 5·10-7 моль/л карбоксиатрактилатом, специфическим ингибитором АТФ/АДФ-антипортера. АДФ, добавленный как с олигомицином, так и без него, также уменьшал стимуляцию дыхания малыми дозами пальмитата.

Возможный механизм разобщения жирными кислотами, опосредованного участием АТФ/АДФ-антипортера, состоит в следующем.

Предполагают, что антипортер построен из "статора", несущего "ворота" для нуклеотидов, которые блокируются карбоксиат-рактилатом, и "ротора", ответственного за обмен АТФ4- на АДФ3-. Анионы жирных кислот (А-) достигают, минуя "ворота", нуклеотид-связывающих центров, например NН+3-групп остатков лизина антипортера. Затем А- переносятся через мембрану ротором, вращающимся под действием Δψ.

Облегчение трансмембранного перемещения анионов А- может иметь принципиальное значение для разобщенного действия жирных кислот, поскольку их анионные формы задерживаются на поверхности раздела мембрана/вода, ориентируясь карбоксильной группой в сторону воды, а жирным "хвостом" - в сторону липида. Именно поэтому мембраны плохо проницаемы для анионов жирных кислот и хорошо проницаемы для их нейтральных (протонированных) форм (АН). Если АТФ/АДФ-антипортер может переносить А-, это обстоятельство должно повысить эффективность жирных кислот как разобщителей.

В хорошем соответствии с этой логикой находятся наблюдения Л. М. Цофиной и Т. В. Выгодиной, показавших, что пальмитат не способен ни повышать протонную проводимость плоских фосфоли-пидных мембран, ни тормозить генерацию Δψ в цитохромоксидаз-ных протеолипосомах.

В тех же условиях грамицидин и ХКФ снимали дыхательный контроль и тормозили образование Δψ как в митохондриях, так и в протеолипосомах, причем этот эффект оказался устойчивым к карбоксиатрактилату.

Опыты, проведенные в лаборатории автора, показали, что разобщающее действие больших концентраций пальмитата уже не удается снять карбоксиатрактилатом. Можно думать, что какие-то другие переносчики анионов вступают в реакцию при повышении концентрации жирной кислоты.

Разобщение жирными кислотами было впервые описано Б. Прессмэном и Г. Ларди еще в 1956 г. Значительно позднее выяснилось, что жирная кислота и жирный ацил-KoA тормозят АТФ/АДФ-антипорт. Бонгкрековая кислота, мощный ингибитор АТФ/АДФ-антипортера, представляет собой ненасыщенную жирную кислоту с тремя карбоксильными группами. Две из них расположены на расстоянии 0,55 нм, равном таковому между ионизованными атомами кислорода соседних фосфорильных остатков в АДФ и АТФ. В карбоксиатрактилате также есть две соседние карбоксильные группы, расстояние между которыми составляет 0,55 нм.

То обстоятельство, что жирные кислоты не только повышают Н+, но и конкурируют с адениннуклеотидами за АТФ/АДФ-антипортер, должно страховать клетку от истощения фонда внемитохондриального АТФ в условиях разобщения, когда Н+-АТФ-синтаза начинает действовать в обратном (гидролитическом) направлении. Истощение АТФ, помимо всего прочего, могло бы блокировать окисление жирных кислот, служащих не только регулятором сопряжения, но и основным субстратом дыхания на холоде. Активация жирных кислот путем их соединения с КоА за счет энергии АТФ происходит во внешней мембране митохондрий.

Следует отметить, что термогенин - белок, специализированный на трансмембранном проведении протонов в митохондриях бурого жира, во многом подобен по аминокислотной последовательности и доменному строению АТФ/АДФ-антипортеру. Перенос Н+ термогенином также активируется жирными кислотами и тормозится пу:риновыми нуклеотидами (см. ниже). Поэтому можно полагать, что как в мышцах, так и в буром жире жирные кислоты служат медиаторами терморегуляторного разобщения в митохондриях, однако в первом случае мишенью жирных кислот оказывается АТФ/АДФ-антипортер, а во втором - специальный белок, представляющий собой, видимо, особую модификацию антипортера.

Другая весьма важная характеристика разобщения жирными кислотами состоит в том, что здесь не требуется специального механизма для прекращения разобщающего эффекта. Разобщение исчезает само по себе, как только скорость поступления жирных кислот в митохондрии станет меньше скорости их окисления. Именно такие соотношения возникают при повышении окружающей температуры, когда отключаются холодовые рецепторы кожи, а с ними прекращается действие регуляторного каскада, обеспечивающего образование жирных кислот из триглицеридов (см. ниже). С прекращением подачи жирных кислот в митохондрию их запас быстро исчерпывается мощной системой a-окисления. В итоге уровень жирных кислот падает и разобщение, вызванное жирными кислотами, исчезает.

Явления, описанные выше, характерны для ответа мышц на повторное охлаждение. Однако в мышцах существует и другой термогенный механизм, включающийся уже при первом воздействии холода. Это мышечная дрожь, поддерживаемая, как любое сокращение мышцы, гидролизом цитоплазматического АТФ. Регенерация последнего происходит за счет транспорта АТФ из митохондрий АТФ/АДФ-антипортером. В митохондриях АТФ образуется Н+-АТФ-синтазой, которая потребляет ΔμH, генерируемую дыхательной цепью. Вероятно, такой путь - слишком длинный и медленный, чтобы резко увеличить продукцию теплоты в условиях внезапного понижения температуры среды. Кроме того, он связан с сильной активацией мышечного сокращения, т. е. специфической функции данной ткани (потребление кислорода организмом при резком охлаждении приближается к таковому при тяжелой мышечной работе). Таким образом, главный принцип терморегуляции: сделать функции независимыми от температуры - в данном случае остается нереализованным применительно к самой "массовой" ткани организма - мышечной. Вот почему мышечная дрожь уменьшается по мере адаптации к холоду.

Все данные, касающиеся терморегуляторного разобщения в мышках, были получены в лабораторных опытах на голубях, мышах и крысах. Позднее этот феномен был воспроизведен Г. Гравом и А. Бликсом на северных морских котиках в природных условиях.

Бурый жир. Многие черты терморегуляторного разобщения жирными кислотами, впервые описанного в митохондриях скелетных мышц, были затем прослежены применительно к митохондриям бурого жира, особой ткани млекопитающих, специализированной на выработке добавочной теплоты при снижении окружающей температуры.

Бурый жир составляет не более 1-2% массы тела. Тем не менее стимуляция этой ткани симпатической нервной системой при охлаждении животных, предварительно адаптированных к холоду, повышает теплопродукцию бурого жира в такой степени, что она может достигать одной трети всей дополнительно образованной в организме теплоты. В этих условиях бурый жир способен выделять до 400 Вт теплоты на 1 кг массы, что на несколько порядков больше обычной термогенной способности тканей млекопитающих (человек в состоянии покоя образует около 1 Вт теплоты на 1 кг массы).

В организме бурый жир сосредоточен в верхней части спины, ближе к шее. Он окружает кровеносные сосуды, питающие кровью мозг. Вот почему теплопродукция в буром жире может иметь огромное значение для выживания организма на холоде.

Первые научные публикации о буром жире датируются XVII веком, но лишь недавно была понята его функция. В 1959 г. Б. Иоханссон написал первый подробный обзор о метаболизме бурого жира. Основываясь на скудной фактической информации тех лет и некоторых предварительных данных, он выдвинул гипотезу, что бурый жир может некоторым образом участвовать в терморегуляции.

Благодаря последующим работам Р. Э. Смита и ряда других исследователей стало ясно, что основной физиологической функцией бурого жира является образование дополнительной теплоты в условиях, когда возрастает теплоотдача организма.

Своим цветом бурый жир обязан митохондриям, содержащимся в огромных количествах в клетках этой ткани. Митохондрии бурого жира оказались хорошо оснащенными именно для образования теплоты. Содержание дыхательных ферментов в них намного превышает таковое Н+-АТФ-синтазы. Но, пожалуй, важнее всего то, что в их внутренней мембране содержится описанный выше особый белок-протонофор термогенин. Термогенин составляет до 15% общего белка митохондрий бурого жира.

Молекулярная масса термогенина равна 33,2 кДа. Недавно удалось выяснить аминокислотную последовательность термогенина из хомяка. Как уже отмечалось, последовательность термогенина напоминает таковую АТФ/АДФ-антипортера. Как и в случае АТФ/АДФ-антипортера мышечных митохондрий, микромолярные концентрации жирных кислот активируют протонофорную функцию термогенина, что и приводит к разобщению.

Привлекательная возможность состоит в том, что термогенин представляет собой монофункциональный вариант АТФ/АДФ-антипортера, утратившего основную (нуклеотид-транспортную) функцию и специализированного на дополнительной функции: разобщении жирными кислотами.

Эксперименты, проведенные на животных in vivo, ткани бурого жира in situ, адипоцитах и митохондриях in vitro, позволили выявить следующую цепь событий, включенных в термогенный ответ этой ткани на понижение температуры среды.

1. Холодовые рецепторы кожи активируются и посылают сигнал в мозг, а именно в терморегуляторный центр гипоталамуса.

2. Из гипоталамуса сигнал поступает в бурую жировую ткань через симпатические нейроны. Из нервных окончаний в пространство между адипоцитами выделяется норадреналин.

3. Норадреналин связывается с B-адренорецепторами, локализованными на внешней стороне плазматической мембраны клеток бурого жира (это и все дальнейшие события проиллюстрированы на рис. 49).

4. B-Адренорецепторы, связав норадреналин, активируют аденилатциклазу. Синергистом норадреналина служит глюкагон, а антагонистом - инсулин. Каждый гормон действует через свой рецептор.

5. Аденилатциклаза образует цАМФ из АТФ.

6. цАМФ включает протеинкиназный каскад, приводящий к активации липазы.

7. Липаза расщепляет триглицериды, содержащиеся в жировых каплях, до жирных кислот и глицерина.

8. Образованные таким путем жирные кислоты выполняют две функции: они служат субстратами дыхания и одновременно вторичными (внутриклеточными) медиаторами гормонального сигнала. Как субстраты жирные кислоты претерпевают обычный цикл катаболитических превращений. Они активируются во внешней мембране митохондрии, давая ацил-KoA. Полученные жирные ацилы транспортируются в митохондриальный матрикспосредством карнитиновой системы, где расщепляются, давая СО2 и восстановительные эквиваленты, под действием ферментов a-окисления.

9. Восстановительные эквиваленты, поставляемые в дыхательную цепь при a-окислении жирных кислот и окислении ацетильных групп в цикле Кребса, переносятся к О2, что сопряжено с образованием протонного потенциала дыхательными ΔμH-генераторами. В результате ионы водорода откачиваются из матрикса в межмембранное пространство.

10. Ионы Н+ возвращаются в матрикс системой термогенин - жирные кислоты. Этот завершающий этап сопровождается выделением теплоты.

Интересно, что не только охлаждение, но и по крайней мере еще два состояния организма, связанные с повышением поглощения кислорода и выделения тепла, сопровождаются разобщением в бурой жировой ткани. Одно из таких состояний - пробуждение животного от зимней спячки. Показано, что бурый жир не атрофируется у зимоспящих животных, адаптированных к термонейтральным условиям. Холодовая акклиматизация повышает количество термогенина в митохондриях бурого жира зимоспящих животных, но не в такой степени, как, например, у крыс или кроликов. Пробуждение хомяков от спячки сопровождается разобщением, которое, по-видимому, особенно важно для разогрева крови, притекающей к мозгу. Из-за локализации бурого жира в области сосудов, идущих к голове, теплопродукция в этой ткани прежде всего вызывает повышение температуры мозга, который переходит в активное состояние сразу же вслед за разогревом бурого жира.

Другая модель - термогенез, обусловленный избыточным потреблением пищи. Н. Ротуел и М. Сток поставили следующий опыт. Взрослым крысам скармливали "ресторанную диету", т. е. разнообразную и вкусную пищу. Потребление животными этой пищи оказалось на 80% большим, чем в контрольной группе, получавшей обычный корм. При этом масса животных за три недели увеличилась только на 27%. Измерение газообмена показало, что хорошо питавшиеся крысы потребляли на 25% больше кислорода, чем в контроле. Эта надбавка исчезала после введения животным пропанолола - антагониста норадреналина. Масса бурого жира за те же три недели опыта возросла более чем втрое; в митохондриях увеличилось количество термогенина. (Оказалось также, что мутация, вызывающая ожирение, сопровождается снижением уровня термогенина у мышей.)

Согласно данным Д. Никольса, митохондрии периферической ткани бурого жира людей в юношеском возрасте по степени разобщения находятся в промежуточном положении между митохондриями той же ткани тепло- и холодоадаптированных морских свинок. Как и у животных, митохондрии бурого жира людей чувствительны к низким концентрациям жирных кислот.

Печень. Митохондрии печени отличаются от митохондрий "быстрых" скелетных мышц и бурого жира, в частности тем, что в их внешней мембране существует очень активный путь свободного окисления: НАДН - цитохром b5. Процесс катализируется флавиновой НАДН-цитохром b5-редуктазой (синонимы: флавопротеин-5; fp5).

Этот путь был открыт А. Л. Ленинджером в 1951 г. В течение длительного времени он оставался загадкой митохондриологии, так как, несмотря на высокую скорость переноса электронов от НАДН к цитохрому b5, дальнейшая судьба восстановительных эквивалентов оставалась неясной. В использованных условиях опыта восстановленный цитохром b5 переносил электроны на добавленный цитохром с, но не на эндогенный цитохром с митохондрий. В результате считали, что митохондрии не способны окислять внешний НАДН со сколько-нибудь заметной скоростью.

Ситуация менялась, если животное перед опытом на митохондриях подвергали воздействию холода. Как показали Е. Н. Мохова и сотрудники, 15-минутное выдерживание на холоде крыс, предварительно подвергнутых серии Холодовых стрессов, приводит к высвобождению в межмембранное пространство части фонда цитохрома с, сорбированного на внешней поверхности внутренней мембраны печеночных митохондрий. Этот эффект сопровождается активацией внешнего пути окисления НАДН.

Проблема, ожидающая своего решения, - механизм восстановления НАДН, который окисляется внешним путем. Субстратами, расщепление которых может привести к восстановлению цитоплаз-матического НАДН, могут быть: 1) глюкоза и гликоген, восстанавливающие НАД+ в реакции гликолитической оксидоредукции; 2) глицерин, высвобождающийся при гидролизе триглицеридов и окисляющийся глицериндегидрогеназой с последующим подключением к цепи реакций гликолиза; 3) некоторые аминокислоты и их метаболиты, расщепляющиеся с участием НАД-связанных дегидрогеназ в цитозоле, и т. д. Кроме того, фонд внутримитохондриальных восстановительных эквивалентов может быть в принципе использован для восстановления НАД+ в цитозоле, если соотношение [НАДН]/[НАД+] вне митохондрии оказывается ниже, чем внутри, и если ΔμH низка. В таких условиях возможно обращение малат-глутамат-аспартатного челночного механизма, обычно используемого для окисления цитоплазматического НАДН митохондриальным НАД+.