Содержание

Химическая работа за счет ΔμH      Н+-АТФ-Синтаза      Н+-Пирофосфат-синтаза      Н+-Трансгидрогеназа Осмотическая работа за счет ΔμH      Определение и классификация      Δψ как движущая сила      ΔpH как движущая сила      Общая ΔμH как движущая сила      ΔμH - Зависимые транспортные каскады      Карнитин как пример трансмембранного переносчика химической группировки      Некоторые примеры ΔμH - зависимых белков-переносчиков      Роль ΔμH в транспорте макромолекул Механическая работа за счет ΔμH: движение бактерий      Структура флагеллярного мотора бактерий      ΔμH вращает ротор флагеллярного мотора      Возможный механизм Н+-мотора      ΔμH - Зависимая подвижность прокариот, не содержащих флагелл, и        внутриклеточных органелл      Подвижные симбионты эукариот и прокариот ΔμH как источник энергии для образования теплоты      Три способа превращения метаболической энергии в теплоту      Терморегуляторная активация свободного дыхания у животных      Терморегуляторная активация свободного окисления у растений

Н+-АТФ-Синтаза- фермент, катализирующий фосфорилирование АДФ неорганическим фосфатом за счет энергии ΔμH; он обнаружен в митохондриях, хлоропластах, дышащих и фотосинтезирую-щих бактериях.

В некоторых анаэробных бактериях, таких, как Streptococcus faecalis, очень похожий фермент осуществляет обратный процесс (АТФ > АДФ + Фн +ΔμH). Эта функция рассматриваемой системы, единственная у S. faecalis, играет подчиненную роль у аэробных и фотосинтезирующих клеток или органелл.

Субъединичное строение. Н+-АТФ-синтазные комплексы, выделенные из разных источников, сходны по своему строению. Каждый из них может быть разделен на два субкомплекса, один из которых отвечает за транспорт протонов (F0), а другой - за синтез или гидролиз АТФ (F1).

Для Н+-АТР-синтазы Е. coli известен субъединичный состав, аминокислотная последовательность и структура оперона. В этом случае фактор F1 состоит из пяти субъединиц (a-B), а фактор F0 - из трех (а-с) (табл. 7). Молекулярные массы F1, F0 и комплекса F0F1 оказались для a. coli равными соответственно 381, 112-184 и 593-665 кДа. Неопределенности в оценке массы фактора F0 и комплекса F0F1 обусловлены тем обстоятельством, что пока еще нельзя с точностью ответить на вопрос, сколько субъединиц типа с содержится в одной молекуле Н+-АТФ-синтазы. В литературе обсуждаются величины от 6 до 15.

Комплекс F0F1 a. coli кодируется одним опероном, который различные авторы называют по-разному: ипс, atp или рар. Его размер около 7 килобаз (kb). Порядок генов соответствует транскрипции матричных РНК, кодирующих субъединицы I, где символом I обозначен гипотетический белок, который еще не выделен.

Митохондриальная Н+-АТФ-синтаза построена из субкомплекса F1 (пять типов субъединиц), субкомплекса F0 (четыре типа субъединиц) и еще четырех дополнительных субъединиц. При этом, как и у Е. coli, фактор F1 содержит субъединицы . Крупные субъединицы (а и B) очень напоминают таковые Е. coli. Так в a-субъединицах фактора F1 из митохондрий сердца быка, дрожжей, Е. coli и хлоропластов содержание консервативных последовательностей составляет около 70%. Подобная ситуация наблюдается и в случае a-субъединицы.

Таблица 7. Субъединичный состав Н+-АТФ-синтазы Е. coli.

Сравнение минорных субъединиц факторов F1 из Е. coli и митохондрий животных показало, что субъединицы a похожи, а a и B - отличны. В то же время в митохондриальной a-субъединице обнаружены последовательности, гомологичные таковым в a -субъеди-нице Е. coli.

Ю. А. Овчинников и сотрудники выяснили аминокислотную последовательность так называемого белка, обусловливающего чувствительность к олигомицину (oligomycin sensitivity coferring protein, или OSCP). Этот компонент служит дополнительной, по сравнению с Е. coli, субъединицей в митохондриальной Н+-АТФ-синтазе. Оказалось, что OSCP в основном гомологичен a-субъединице Е. coli, но имеет несколько большую молекулярную массу (21 кДа по сравнению с 19,3 кДа b-субъединицы E.coli), содержит гидрофобный участок вблизи N-концевой последовательности и несколько протяженных отрезков, гомологичных не a-, а b-субъединице Е. coli.

Гомологом субъединицы с Е. coli в митохондриях служит субъединица 9 (синоним - протеолипид, связывающий ДЦКД).

Последовательности, гомологичные субъединице а Е. coli, были обнаружены в субъединице 6 (масса 22 кДа).

В Н+-АТФ-синтазе митохондрий находят пять полипептидов, которые отсутствуют у бактерий. Это: a-субъединица фактора F1 с массой 5,5 кДа; субъединица AL6 фактора F0; фактор F6 (9 кДа); белковый ингибитор фактора F1 c массой 9,5 кДа и субъединица с массой 18,5 кДа, которая наряду с F6 и OSCP необходима для правильного сязывания F1 c F0.

У животных и дрожжей все субъединицы фактора F1 закодированы в ядерном геноме и синтезируются в цитоплазме в виде несколько более крупных предшественников. У растений a-субъединица кодируется в митохондриях, a - в ядре; место синтеза малых субъединиц фактора F1 остается невыясненным.

Среди компонентов фактора F0 дрожжей митохондриальным геномом кодируются субъединицы 6 и 9. Все прочие субъединицы имеют соответствующие гены в ядре. В геноме митохондрий животных обнаружены два перекрывающихся гена, имеющих отношение к Н+-АТФ-синтазе. Они кодируют субъединицы 6 и AL6.

Субъединичный состав Н+-АТФ-синтазы хлоропластов, обозначаемой CF0CF1 в основном подобен таковым бактерий и митохондрий. При этом a-субъединица гомологична таковой для бактериального типа. Фактор СF0 содержит четыре типа субъединиц, обозначаемых I - IV. Субъединицы IV, I и III гомологичны субъединицам a, b и с фактора F0 Е. coli. Субъединица II не имеет бактериального аналога. Субъединицы I, III и IV синтезируются в хлоропластах. У цианобактерий, тилакоидная мембрана которых содержит как дыхательную, так и фотосинтетическую цепь, фактор F1 оказался того же типа, что и в хлоропластах.

Трехмерная структура и расположение в мембране. Н+ - АТФ-синтазный комплекс так велик, что выдается в воду на довольно большое расстояние с одной стороны мембраны. Выступающая часть, которая представляет собой фактор F1 обращена в цитоплазму бактерий, матрикс митохондрии или строму хлоропласта.

Негативное окрашивание вывернутых субмитохондриальных пузырьков выявляет грибовидные выросты диаметром около 9 нм, располагающиеся по всей поверхности мембраны. Как показал Э. Ракер, выросты исчезают после сильного механического перемешивания суспензий пузырьков, что сопровождается потерей способности пузырьков синтезировать и расщеплять АТФ, а также появлением в растворах сферических частиц диаметром 9 нм и АТФазной активности. Реконструкция сферических частиц с мембраной пузырьков возвращает последним АТФ-синтазную и АТФазную активности. Из этих наблюдений Э. Ракер заключил, что выступы представляют собой каталитическую часть Н+-АТФ-синтазы, т. е. фактор F1.

После отщепления фактора F1 в мембране остается часть Н+-АТФ-синтазы, ответственная за перенос ионов Н+ (фактор F0). Чтобы реконструировать Н+-АТФ-синтазу в протеолипосомах, требуются как F1, так и F0. Результаты компьютерного анализа электронных микрофотографий фактора F1 суммированы на рис. 39. Найдено шесть белковых масс, представляющих собой, по-видимому, крупные субъединицы (три a и три B), которые упакованы в два слоя по три субъединицы в каждом слое. Фронтальная проекция фактора F1 имеет диаметр порядка 10 нм. В центральной части митохондриального F1 иногда удается наблюдать еще одну, седьмую белковую массу, которая могла бы быть комплексом трех мелких субъединиц.

Исследование с использованием малоуглового рассеяния рентгеновских лучей показало, что фактор F1 можно приблизительно описать как эллипсоид с осями 12х9х7 нм.

Многое еще не выяснено в вопросе о том, каким образом F1 прикрепляется к фактору F0 погруженному в мембрану. Были получены данные, что по крайней мере a-субъединица фактора F1 может находиться в прямом контакте с фосфолипидами. Это наблюдение противоречит распространенной точке зрения, что Н+-АТФ-синтаза всегда выглядит как гриб, шляпка которого соединяется с мембранным сектором посредством довольно длинной ножки. Не исключено, что грибовидная конфигурация фиксируется в результате обработки, предшествующей анализу образца под электронным микроскопом.

Существует весьма косвенная информация о трехмерной структуре фактора F0. Ее источником служит, в частности, рассмотрение чередований гидрофобных и гидрофильных участков аминокислотных последовательностей субъединиц, составляющих фактор. Пред полагают, что очень гидрофобные а- и с-субъединицы образуют соответственно шесть и две a-спиральные трансмембранные колонны. Что касается b-субъединицы, то она пересекает мембрану, по-видимому, только один раз.

Гидролиз АТФ изолированным фактором F1. Фактор F1 будучи отделен от мембранного сектора Н+-АТФ-синтазы, сохраняет способность гидролизовать АТФ до АДФ и фосфата. Реакция протекает с очень большой скоростью и утрачивает чувствительность к олигомицину, диэтилстильбестролу и низким концентрациям ДЦКД, отличаясь в этом отношении от комплекса F0F1.

Гидролиз АТФ растворимым фактором F1 был исследован в целом ряде лабораторий, однако и сегодня многие существенные моменты механизма этой реакции остаются неясными.

Твердо установлено, что фактор F1 может связывать шесть молекул адениннуклеотидов, т. е. по одному на каждую крупную субъединицу.

Как a-, так и B-субъединицы фактора F1 содержат весьма консервативные последовательности, подобные тем, что найдены в других АТФ-связывающих ферментах. Три места связывания нуклеотидов гораздо быстрее обменивают связанные нуклеотиды, чем остальные места. Поэтому в факторе F1 различают прочно и слабо связанные нуклеотиды. В условиях, когда заполняется только один центр связывания нуклеотидов, гидролиз АТФ идет очень медленно (так называемый одноцентровый катализ). Связывание второй АТФ вызывает многократное ускорение реакции, что обусловлено увеличением скорости высвобождения продуктов (АДФ и фосфата) из активного центра.

Как показали А. Д. Виноградов и сотрудники, гидролиз АТФ изолированным митохондриальным фактором F1 сильно тормозится одним из продуктов реакции - АДФ.

По данным, полученным Я. М. Мильгромом и М. Б. Мураталиевым, это торможение обусловлено АДФ, связанным в некаталитическом центре фактора F1.

Установлено, что для удаления АДФ из ингибированного фактора F1, находящегося на мембране, требуется ΔμH. Это означает, что торможение посредством АДФ может развиваться только в том случае, если ΔμH снижен, т. е. именно тогда, когда есть опасность исчерпания фонда АТФ в клетке за счет обращения Н+-АТФ-синтазной реакции.

В митохондриях ту же функцию, что и АДФ, может выполнять особый полипептид - белковый ингибитор. В хлоропластах он, по-видимому, идентичен B-субъединице.

Подобно АДФ, белковый ингибитор подавляет АТФазную активность изолированного фактора a, а также комплекса F0F1 в мембране при условии, когда ΔμH снижен.

Показано, что гидролиз АТФ в каталитическом центре a происходит путем прямой атаки молекулой воды ангидридной связи АТФ:

Процесс протекает без образования ковалентных интермедиатов. Об этом свидетельствуют как данные опытов по изотопному обмену, так и тот факт, что гидролиз АТФ фактором F1 устойчив к ванадату, гидроксиламину и другим реагентам на ацилфосфат.

Синтез связанного АТФ изолированным фактором F1
Проведение протонов через фактор F0
Стехиометрия Н+/АТФ
Возможные механизмы превращения энергии